离子交换层析

简介

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。

基本原理

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。

从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。

阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。

各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。

蛋白电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。每个蛋白具有等电点（pI），即负电荷和正电荷的总数为零的pH。在低于蛋白pI的缓冲溶液中，蛋白带正电并将结合阳离子交换树脂的带负电荷的官能团。在高于蛋白pI的缓冲液中，蛋白是带负电荷的，并且将结合阴离子交换树脂的带正电荷的官能团。原则上，蛋白可以结合阳离子或阴离子交换树脂，但在实践中，蛋白质仅在窄pH范围内稳定，并且树脂的选择取决于蛋白质的pH稳定性。

离子交换剂的种类和性质

1.离子交换剂的基质

离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。

以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基质。

2.离子交换剂的电荷基团

根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH 范围，强酸型离子交换剂在较大的pH 范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH 范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团(-SO3H)，如磺酸甲基(简写为SM)、磺酸乙基(SE，应为常见的SP柱)等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团(-PO3H2)和亚磷酸基团(-PO2H)为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基(-OH)或羧基(-COOH)，如羧甲基(CM)为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H+离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子交换剂对H+ 离子的结合力比Na+离子大。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团(-N(CH3)3)，如季胺乙基(QAE，即常见的Q柱)为强碱型离子交换剂，结合叔胺(-N(CH3)2)、仲胺(-NHCH3)、伯胺(-NH2)等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基(DEAE)为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子小，弱酸型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子大。

(3)交换容量 交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。 影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。 另一些影响因素如实验中的离子强度、pH 值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH 对弱酸（CM）和弱碱型(DEAE)离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH 较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH 时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时pH 也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH 以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。**实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。**离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数(meq/mg或meq/mL)来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl 处理，使其平衡离子为H+。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl 充分置换出H+，再用标准浓度的NaOH 滴定生成的HCl，就可以计算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将H+充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。

对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。

离子交换剂的选择、处理和保存 (1)离子交换剂的选择 离子交换剂的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换剂。 首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。

其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。 另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示，目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换剂适于需要高分辨率的分析或分离。 这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用，它们在生物大分子物质(蛋白质，酶，核酸等)的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。

(2)离子交换剂的处理和保存 离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na 型(即平衡离子是Na 离子)，阴离子交换剂为Cl 型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH 或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na 型，阴离子交换剂为Cl 型。使用的酸碱浓度一般小于0.5mol/L，浸泡时间一般30min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。 离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。前面介绍的酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用HCl 处理可将其转为Cl 型，用NaOH 处理可转为OH 型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都 是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。 前面已经介绍了，离子交换层析就是通过离子交换剂上的平衡离子与样品中的组分离子进行可逆的交换而实现分离的目的，因此在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H 或OH 离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H 或OH 型离子交换剂，因为分离过程中H 或OH 离子被置换出来都会改变层析柱内pH 值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4°C 下保存。

离子交换层析的基本操作

离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。 (1)层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。

(2)平衡缓冲液 离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH 的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下(如污水处理)可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。 另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。

(3)上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。

(4)洗脱缓冲液 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH 的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH 从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH 从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。 洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。

(5)洗脱速度 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。

(6)样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。

离子交换层析的应用 离子交换层析的应用范围很广，主要有以下几个方面。 (1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过H+ 型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH- 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。

(2)分离纯化小分子物质 离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2~3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。

(3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。

天地人和DEAE Beads 6FF

性能指标
基质高度交联的6%琼脂糖微球
离子交换类型弱阴离子
离子载量约0.11-0.16mmol/ml介质
粒径 (μm)45-165
建议流速300-600cm/h
pH 稳定范围2-12
储存缓冲液含20%乙醇的1XPBS
储存温度4°C – 30°C

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疏水作用层析

原理

疏水作用层析是根据分子表面疏水性不同来分离生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

在疏水相互作用色谱中，基质材料被疏水基团取代，这些基团可以是甲基，乙基，丙基，丁基，辛基，或苯基。在高盐浓度下，蛋白质表面的非极性侧链与疏水基团“相互作用”；也就是说，两种类型的基团都被极性溶剂排除在外(疏水效应因离子强度的增加而增强)。因此，样品被应用于高度极性的缓冲器中的柱上，从而驱动分析物上的疏水基团与固定相的结合。洗脱液通常是一种水缓冲液，盐浓度降低，洗涤剂浓度增加(这会破坏疏水相互作用)，或pH变化。硫酸铵经常用于这一目的。加入有机溶剂或其他不太极性的成分可能有助于提高分辨率。

操作特点

疏水层析的基本操作与其他层析大致相同。所要注意的事项有以下方面：

  • 1、层析柱的制备进行疏水层析时，所使用层析柱之规格包括柱体积大小、直径粗细、柱高度（h）与其直径（d）的比值等，均与普通层析的相似。在分离样品量较大时，宜选用体积较大的层析柱，h:d的比值应≤3。
  • 2、平衡疏水层析柱装柱完毕后，通常要用含有高盐浓度（如1mol/L （NH4）2SO4或2mol/L NaCl）的缓冲液进行平衡。
  • 3、加样与洗脱加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。通常加1mol/L （NH4）2SO4或2mol/LNaCl，以使样品中的生物大分子局部变性，并能与固定相很好地相互吸附。加盐的样品溶液要混匀，放置片刻后即可上柱，当把此样品溶液徐徐加入固定相（使生物大分子与固定相之间作用0.5~1h）后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。
  • 4、再生洗脱后的层析柱欲重复使用时，需对其固定相进行再生处理，即用含8mol/L尿素的缓冲溶液洗涤层析柱（以除去固定相吸附的杂质），接着用平衡缓冲液平衡。采用此程序处理过的疏水层析柱，可重复使用。

特点与应用

1、疏水柱层析特点：

  • （1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；
  • （2）分辨率很高、流速快、加样量大；
  • （3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。

2、疏水柱层析应用：疏水柱层析适用于分离的任何阶段，尤其是样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。

天地人和Phenyl Beads 6FF(High Sub)柱料

是低取代的芳香族疏水层析介质和高取代的芳香族疏水层析介质，其中苯基通过不带电、化学性质稳定的醚键连接至高度交联的6%琼脂糖微球上。

性能指标
基质高度交联的6%琼脂糖微球
配体苯基
载量(/ml介质)High Sub :约30mg lgG 、36mg HSA
粒径 (μm)45-165
建议流速(cm/h)300-600cm/h
pH 稳定范围3-13
储存缓冲液含20% 乙醇的 1XPBS
储存温度4°C – 30°C

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。 平衡/洗杂液: 0.05 M磷酸盐（可换用Tris-HCl），1.7 M硫酸铵，pH7.0 洗脱液: 0.05 M磷酸盐，pH7.0 注:疏水层析介质缓冲液可根据不同介质及纯化物质不同做适当改变，原则上高盐上样低盐洗脱。.

纯化

孵育法纯化
  • 1)根据纯化的样品量，取适量Phenyl Beads 6FF(High Sub)加入离心管中，1000 rpm离心1 min,吸弃,上清;也可加入重力柱中，流干保护液。
  • 2)向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min,吸弃上清;如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液;重复两次以上。
  • 3)加入样品，封闭离心管或重力柱管，4’C振荡孵育2-4 h或者37C孵育30 min-2 h。
  • 4)孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿,用于电泳鉴定。
  • 5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清(注意不要吸到介质)，重复3-5次,中间建议更换新离心管。
  • 6)加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育10-15 min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。
重力柱法纯化
  • 1)将装填好的Phenyl Beads 6FF(High Sub)重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。
  • 2)将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
  • 3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
  • 4)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每0.5个柱体积收集1管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
中压层析柱法纯化

Phenyl Beads 6FF(High Sub)装填好后,可以用各种常规的中低压色谱系统。

  • 1)将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中,打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
  • 2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
  • 3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
  • 4)利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少,也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。 大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
  • 5)用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
  • 6)用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
  • 7)上述步骤介质洗脱结束后，先用平衡液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8℃保存。

注:疏水作用随着温度的降低而降低。可采用非极性有机溶剂如40~50%乙二醇、30%异丙醇或1%去污剂TritonX-100洗脱。

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广泛分布的IS200/IS605转座酶家族编码了多种RNA Guide的核酸酶

1.本文从IS200/IS605转座子重建了CRISPR-Cas9系统的进化，发现IscB使用单个 ncRNA 进行RNA 引导的双链DNA切割并且可以用于人类细胞中的基因组编辑。还证明了由 IS200/IS605转座子编码的另一个TnpB蛋白也有RNA Guide的核酸酶活性，该蛋白推测为Cas12内切核酸酶的祖蛋白。

2.这项工作揭示了一类广泛的转座子编码的RNA引导的核酸酶，本文将其命名为OMEGA（专性移动元件引导活性），具有作为生物技术发展的巨大潜力。由于TpnB分布更为广泛，后续真核基因编辑只需要导入RNA即可引导内源性核酸酶进行基因编辑。

3.同时TnpB的Spacer调控得当，可以表达单一核酸内切酶融合不同crRNA实现9~12bp Type IIS核酸内切酶，解决现有限制性内切酶瓶颈。

IscB蛋白（insertion sequence Cas9-like OrfB,参考文章Kapitonov VV et al. J Bacteriol. 2015 Dec 28;198(5):797-807.）是在IS200/IS605转座子的不同家族中编码的推定核酸酶，可能是RNA引导的核酸内切酶Cas9的祖先，但IscB的功能及其与任何RNA的相互作用仍未表征。原核RNA引导的防御系统CRISPR-Cas9（II型CRISPR-Cas）已被用于真核细胞中的基因组编辑，被认为是从IscB蛋白进化而来的。尽管其在原核生物中广泛分布并且与Cas9共享域组成和体系结构，但IscB的功能仍然未知。此外，鉴于尚未报道IscB与非编码RNA（ncRNA）或CRISPR阵列相关，Cas9系统中RNA引导活性的进化起源尚不清楚。

IscB长约400个氨基酸，含有通过插入桥螺旋（BH）和HNH内切核酸酶结构域分裂的RuvC内切核酸酶结构域，该结构与Cas9共享。对含有HNH或分裂RuvC核酸内切酶结构域的蛋白质进行了全面搜索，发现Cas9和IscB是唯一含有两个结构域的蛋白质。还显示IscB含有先前未鉴定的N末端，其与已知结构域缺乏明显的同源性，并且在Cas9中不存在，在其保守序列基序后表示PLMP。RuvC，BH和HNH结合域的聚类和系统发育分析强烈表明，所有现存的Cas9都来自单个祖先IscB。从每个簇中搜索与IscB基因相邻的CRISPR阵列，发现了六个不同的IscB组，包含16个簇（共603个），与CRISPR相关，与以前的观察相反。CRISPR相关的IscB分散在IscB系统发育树周围，这表明它们独立进化，一个关联事件导致Cas9谱系。总共鉴定了31个独特的CRISPR相关iscB基因座（共2811个）。首先检查了一组CRISPR相关的ISCB，类似于非CRISPR相关的ISCB（氨基酸同一性约为50%）。在大肠杆菌中异源表达来自该进化枝的代表性基因座并进行小RNA-seq，其显示不仅CRISPR阵列的表达，而且CRISPR阵列和IscB开放阅读之间的329碱基对（bp）基因间区域框架（ORF）。本文还纯化了IscB蛋白并对共纯化的RNA进行了测序，证明该蛋白与包含CRISPR阵列和该基因间区域的单个ncRNA组分相互作用。鉴于其与包含CRISPR直接重复（DR）和间隔区的ncRNA的相互作用，以及其与Cas9类似的结构域结构，测试了该IscB的RNA引导的核酸内切酶活性。使用先前建立的原型间隔区相邻基序（PAM）-发现测定，观察到特定PAM序列的消耗，表明CRISPR相关的ISCB是可重编程的RNA引导的核酸酶。发现IscB至少在功能上与CRISPR相关，并且可能在其他情况下，表明IscB系统更一般地共享核心祖先ncRNA基因，该基因易于进化成CRISPR阵列，并且在某些情况下是单独的反式激活CRISPR RNA。为了验证这一假设，比对了563个非冗余iscB基因座，并在iscB ORF的上游或下游搜索保守核苷酸（nt）序列。该分析揭示了ORF上游长度约300bp的高度保守的基因间区域，其5’末端的保守性下降，这对应于IS200/IS605转座子末端。共有CRISPR相关的IscB ncRNA和协方差折叠的RNA二级结构的比较揭示了高度的结构和序列相似性，特别是在共享的多干区域和假结中。推断wRNA中5′-最不保守的序列可能起指导序列的作用，因为预测紧邻下游的序列形成发夹，其结构类似于CRISPR相关IscB中DR/抗重复双链体形成的发夹ncRNA。

为了检测IscB是否能够切割与假定的wRNA指南互补的DNA，使用体外转录/翻译（IVTT）表达系统用KraIscB-1进行了体外质粒切割试验。发现KraIscB-1以wRNA依赖性方式切割靶标，具有ATAAA 3’靶标邻接基序（TAM）。使用不同的指南（Fn指南）重新定位KRAISCB-1切割同源靶标，暗示IscB是可重编程的RNA引导的核酸酶。接下来在体外对IscB进行了生物化学表征。我们通过鉴定TAM确定了86个（66%）选择的系统发育不同系统中的57个的活性。在这57个功能性ISCB中，5个可以在体外用相应的wRNA重建以实现有效的靶标切割，并且从中选择了AwaIscB用于详细的生物化学表征。证实了重组AwaIscB以可编程方式切割多个双链DNA（dsDNA）靶标的能力，并显示AwaIscB的活性依赖于镁，最适温度为35°至40°C。催化RuvC II残基（E157A）的突变消除了对非靶DNA链的核溶解活性，而HNH结构域催化突变体H212A消除了对靶链的核溶解活性。E157A和H212A突变（dAwaIscB）的组合消除了所有dsDNA核酸分解活性。切割产物的测序显示AwaIscB切割TAM上游3nt的靶链，类似于Cas9。非靶链的切割发生在TAM上游8或12 nt，产生长度为5或9 nt的5’突出端（切割不同cas9的平末端。会留粘性末端，但切割位点在识别位点内部，不能用于GoldenGate）。

RNA引导系统的显着优点是它们允许效应子通过简单地重编程RNA指导来靶向许多底物。IscB发展为使用多个指南的一种方法是与CRISPR阵列相关联。鉴于iscB基因座通常编码单个wRNA，因此不清楚这些系统通常如何或甚至是否实现这种模块化。通过搜索不直接与iscB ORF相邻的wRNA，发现了三种用于指导编码和切换的额外潜在机制：wRNA阵列，转座子扩增和独立的反式作用wRNA。wRNA阵列由多个wRNA组成，每个wRNA包含不同的指导，间隔高达200bp，并且在3356个独特的IscB/IsrB基因座中的15个（0.4%）中发现。转座子扩增涉及在多个位置插入几乎相同的IS200/IS605超家族转座子，导致每个基因组有多个基因座，每个基因座能够用独特的指导表达几乎相同的wRNA支架。相比之下，独立的wRNA更常见，并且在一些基因组中以多拷贝发现，其显示与iscB没有可检测的基因组关联。来自3356个独特IscB/IsrB基因座中的95个（2.8%）的顺式-wRNA几乎相同(≥95%序列同一性）到远端编码的独立wRNA，这意味着这些独立的wRNA可以编码反式编码的ISCB使用的指导。通过检查K.racemifer基因组中的10个独立的wRNA来测试这种可能性，其中9个被发现表达。在测试的6个独立的wRNA中，发现5个可以用来自相同基因组的远端编码的IscB介导RNA引导的DNA切割，证明单个IscB可以使用多个反式编码的wRNA。来自许多wRNA的指导，包括IscB相邻和反式编码，主要靶向原核基因组序列，表明IscB系统具有非缺失功能。

接下来研究了IscB，Cas9和其他同源蛋白之间的进化关系，以更广泛地了解RNA引导机制的进化。在寻找包含分裂的RuvC结构域的蛋白质时，检测到另一组较短的 350个氨基酸的IscB同源物，它们也编码在IS200/IS605超家族转座子中。这些蛋白质含有PLMP结构域和分裂的RuvC，但缺乏HNH结构域。将这些蛋白质IsrB（插入序列RuvC-like OrfB）重命名为强调它们独特的结构域，取代了之前的名称IscB1。除了IscB和IsrB之外，还鉴定了仅包含PLMP结构域和HNH结构域但不包含RuvC结构域的更小的蛋白质家族（约180个氨基酸），将其命名为IshB（插入序列HNH样OrfB）。为了研究这些蛋白质之间的关系，使用IQTREE 2从分裂的RuvC核酸酶和BH结构域的多重比对构建了最大似然（ML）树。在得到的树中，IsrB，IscB和Cas9形成了独特的，强烈支持的进化枝，这表明这些核酸酶中的每一个都起源于独特的进化事件。然后分析了每个蛋白质簇与IS200/IS605 tnpA基因，wRNAs，CRISPR-Cas适应基因（cas1，cas2，cas4和csn2），相应ORF上游和下游的CRISPR阵列之间的关联，以及CRISPR反重复。如上所述，iscB和isrB很少与CRISPR阵列相关，并且未发现与CRISPR-Cas适应基因相关。ISRB与结构上不同的wRNA相关。此外确定了两个不同的Cas9s组。第一种是新亚型II-D，一组相对较小的cas9s（~700个氨基酸），与任何其他已知的cas基因无关。第二个是从II-C亚型内分支的独特分支，其包括与tnpA相关的特别大的cas9s（>1700个氨基酸）。tnpA相关的II-C基因座通常包含异常长的DR（长度超过42bp），并且在一些情况下编码cas9和其他cas基因之间的HIRAN结构域蛋白。预测的转座子末端围绕这些基因座中的tnpA，cas获取基因和CRISPR阵列的各种组合。这些系统发育和关联分析证实IS200/IS605转座子编码的ISCB和ISRB与Cas9具有共同的进化历史。鉴于IsrB进化枝在树中的深部位置和缺乏HNH结构域，IsrB可能代表祖先状态，可能是从紧凑的RuvC核酸内切酶进化而来的。几乎所有ISRB都与wRNA相关；这表明这些系统在进化的早期阶段成为RNA引导的。IsrB随后获得了HNH结构域，可能是通过插入另一个移动元件或与编码IshB样蛋白的基因重组，建立了IscB家族。CRISPR阵列出现在IscB系统中多次独立的场合。这些短阵列由重复序列组成，这些重复序列可以通过复制祖先wRNA的片段而进化。得到的系统包括杂交CRISPR-wRNA，其由部分wRNA之前的CRISPR阵列组成。这些CRISPR相关的IscB蛋白可能在许多情况下也在RuvC-I和RuvC-II亚结构域之间获得REC样插入，通常与CRISPR结合同时或之后不久。特别是，一个CRISPR相关的IscB簇（簇2089）可能在标志性PLMP结构域丢失后建立了Cas9家族。此外，亚型II-D的tracrRNA，Cas9子树中的深分支显示与IscB wRNA显着相似，这表明Cas9 tracrRNA最初是从wRNA进化而来的。最后，在与CRISPR适应机制（cas1，cas2和可能的cas4）相关联后，Cas9多样化的爆发和通过水平基因转移在细菌之间的广泛分散随后，导致多种II型CRISPR亚型的进化。我们还探索了wRNA的进化历史。通过迭代构建一组跨越与ISCB和ISRB相关的所有主要RNA组的wRNA谱，我们发现不同的wRNA与几乎所有ISCB和ISRB相关。此外，不同的IsrB和IscB进化枝与不同的wRNA结构相关。从isrB到iscB的转变可能伴随着isrB相关的wRNA中转座子末端区域和多茎环之间的第二个假结，即衔接子假结的丢失。wRNA结构的复杂性与相关蛋白质大小之间的反比关系也反映在与大ISCB的进化枝相关的简化的wRNA结构和与大Cas9s相关的甚至更小的tracrRNA上。

除了产生丰富多样的II型CRISPR系统的进化事件的独特连续性之外，系统发育分析还揭示了IscB和相关蛋白进化中的其他几个事件导致了现存的多样性。首先在真核生物基因组中搜索了IscB同源物，并在陆地绿藻Ignatius tetrasporus UTEX B 2012的叶绿体基因组中鉴定了多个IscB基因座。尽管ORF在大多数这些基因座中被多个终止密码子破坏，但一个基因座编码完整的IscB（与相关的原核IscB具有约50%的氨基酸同一性）和转录活性的wRNA。该真核IscB用最小的NNG TAM切割DNA(实际应为原核生物的IscB，或者把叶绿体发展为一个遗传载体，或者部分质体基因已经转移到核基因。应该还有更多的转座子待发现，用于后续真核基因编辑。)，其不同于其他表征的IscB TAM。其次研究了大型ISCB的进化枝，其中包含一个BH域，该域通过类似REC域的插入被分成两部分。假设这些插入可能会增强DNA解旋，类似于Cas9的REC叶，因此将促进真核染色质结构复杂景观中的基因组编辑。在人类基因组中的46个位点上，发现OgeuIscB在28个这些位点诱导插入缺失，效率高达4.4%。因此，OgeuIscB似乎是进一步开发基于IscB的基因组编辑工具的有希望的候选者。第三，通过实验表征了IscB的明显祖先IsrB的假定核酸酶活性。Kracemifer含有5个与天然表达的WRNA相关的ISRB。发现IsrB-wRNA RNP以指导和TAM特异性方式切割dsDNA底物的非靶链，这类似于IscB的活性。灭活HNH结构域。最后，试图确定IS200/IS605转座子是否一般含有RNA引导的核酸酶。除了独特的IscB和IsrB家族外，大多数IS200/IS605转座子编码另一个家族的RuvC样核酸内切酶TnpB，它被认为是V型CRISPR效应子Cas12s的祖先。此外，TnpB可能是编码在不同真核转座子中的较大蛋白质Fanzors的祖先。先前的工作已经鉴定了与古细菌和细菌中tnpB基因的3’末端重叠的ncRNA，但这些ncRNA的功能尚未表征。K.racemifer的小RNA-seq揭示了与相关tnpB ORF的3’末端重叠的ncRNA的天然表达，将其归类为不同的wRNA组。KraTnpB wRNA 3’末端的反向互补几乎与与一些KraIscBs相关的wRNA的5’相同，该区域对应于每个基因座中预测的转座子末端对含有与KraTnpB聚集的tnpB基因的非冗余基因座的分析显示，在基因座的3’末端，对应于IS200/IS605转座子末端，序列保守性下降。与小RNA-seq迹线的比较显示表达超出保守下降，表明转录物中可能存在指导序列。使用重编程的指导对来自该簇的多种TnpB蛋白的体外质粒切割测定证明了用5’TAM进行RNA引导的切割。从AmaTnpB重组纯化TnpB并证实其可重编程的RNA引导的dsDNA内切核酸酶活性。在识别dsDNA或ssDNA底物时，AmaTnpB强力切割含有靶的单链DNA（ssDNA）底物并且非特异性切割侧枝底物。

通过探索Cas9进化，发现了三种高度丰富但以前未表征的转座子编码核酸酶的可编程RNA引导机制：IscB，IsrB和TnpB，统称为OMEGA（专性移动元件引导活性），因为移动元素的定位和移动可能决定了他们指南的身份。虽然OMEGA系统的生物学功能尚不清楚，但有几个假设与现有证据相符，包括促进TNP催化，RNA引导转座或作为毒素的作用，转座子作为抗毒素，确保维持IS200/IS605插入。

TnpB家族比IscB家族更加丰富和多样化，在细菌和古细菌基因组中鉴定了超过100万个推定的tnpB基因座，使其成为最常见的原核基因之一。这些TNPB可能代表了未开发的丰富的各种RNA引导机制，不仅存在于原核生物中，而且存在于真核生物中。结合对叶绿体编码的IscB的鉴定，这些发现表明RNA引导系统扩展到真核基因组中可能是一种普遍现象，更广泛地说，RNA引导系统在功能上是多样的并且渗透到生命的所有领域。

RNA表达框构建方式：snoRNA启动子+（tRNA）+Spacer（12bp左右）+ωRNA+PolyT（6~10个）。

实验相关数据：

I. tetrasporus IscB:其TAM为NNG。

atgaatacaatcttggttttatcaagtattaaaataccgcttatgcccagtcatccagcacgggcacggcaattgatccaatcgggaaaagctaaagtttatcgacataatccatttacaatcattttgactgaacgcaaccaaggaaatattcaacctattgaatgcaaaattgatccaggtagtcaaactacaggaatggctttggttgttcaaggcaaaaaacaaacaaaagcacttttaggtattcatttaaaacatagaggcaaacatattacccaagccttgaaaaaacgaagtgttagtcgcaaatttcgtcgatcaagaaaaactcgttatcgaccaccccgttttttaaaccgaacacggccaatagggtggttaccgccatcaattaattcgcgtttaaacaacataaccaattgggttcgcaaacttaaagtttgggcacccttaagcagtattgaagttgaaaatgtcaaatttgatattcaaaagcttcagaatccagaaatccaaggtattgaataccaacaaggaacattaatgggttatgaagttcgtgaatatatattagaaaagttccacaagacgtgcgcgtattgcggtcaaaccaaagggcgtttagaaatagaccatattatccctaaaagcaaagggggtagtaaccgcatgagtaatttaacattagcttgtcaacgttgtaatcaaaaaaaaggaaaccaaagtcttacagaatttgttaaaaataaacaaaaattggagaaaatcaaagcacaatgcagaacttcctttaaagatgcagctattgtgaattccatgcgtaaagctttggtttcaactttaaaaaagttccacttaccagtgtattgttggtccagtggattaaccaaatacaaccgagtaagacaaaactatgaaaaacaccattggattgatgcagcttgtgttggaaattcaggttccaatgtttgtttaccgcgtaattcatccgtattaaccataactgcaatgggtcggggtaatcgaaaaaaatgccaaatgaataaatatggatttccaaaaagcaaacccaaacaggccaaacgtgtacacggtttggataccggtgattgggtaaaaatcagagctcttagccctgaacaaaatgccaatcgaaacgaaaaaaaccaaataactcgacctgtttacggtcgtgtaacagtaagagccactgggaactttgctgtgacgcccaaaaacggcaaacaagtttctattatgtataaatattgctttttgctgcaaaaaaatgatggttataactatacttag

I. tetrasporus IscB ωRNA:

gtcaatgacccattttcaataacacaatgagcaagcgaagcggggagttttgctccccaaatccagagctcctttacattgacccggctcagggacttctaagttcctacgttagcagttaatattataggtaccccagaatgcttcaccagttcgagggctctacggtaagtggttaaacaagtggaaggggttaaactagtgctgcttacataaacaactgcataacattgccaaggtgacgtgattcatactaagctctaagctagcatgagtcacaccaccatgcaagtgtgtaaatgcttttcgctcacttgcatgagagtgattgaaggtaact

OgeuIscB： 其TAM为NWRRNA。

ATGGCCGTGGTCTACGTGATCTCTAAGTCCGGCAAACCACTGATGCCCACCACCAGATGCGGCCACGTGCGGATCTTGCTCAAGGAAGGCAAGGCTAGAGTGGTGGAAAGAAAGCCCTTCACCATCCAGCTGACCTACGAGTCTGCCGAGGAAACCCAGCCTCTGGTGCTGGGCATTGACCCTGGCAGAACCAATATCGGTATGAGCGTGGTGACCGAGAGCGGAGAGAGCGTGTTCAACGCCCAAATCGAGACAAGAAACAAGGACGTGCCTAAGCTGATGAAGGACAGAAAGCAGTATAGGATGGCCCACAGAAGGCTGAAGCGGCGGTGCAAAAGACGGCGGAGAGCCAAGGCTGCCGGCACCGCCTTCGAGGAGGGCGAAAAGCAAAGACTGCTGCCTGGCTGCTTCAAGCCTATTACATGCAAGAGCATCCGGAACAAGGAAGCCAGATTCAACAACCGCAAGCGGCCTGTGGGATGGCTGACACCTACCGCCAATCACCTGCTGGTCACCCACCTGAACGTGGTTAAGAAGGTGCAGAAGATCCTGCCCGTGGCCAAGGTGGTGCTGGAGCTGAATCGGTTCAGCTTTATGGCCATGAACAACCCCAAGGTTCAGAGATGGCAGTACCAGCGGGGCCCTCTGTACGGCAAAGGCAGCGTGGAAGAGGCCGTGTCCATGCAGCAGGATGGACACTGCCTGTTTTGTAAACACGGCATCGACCACTACCACCACGTGGTCCCCAGAAGAAAGAACGGCAGCGAGACACTGGAAAACAGAGTGGGCCTTTGTGAAGAACACCATAGACTGGTGCACACAGATAAGGAGTGGGAGGCCAACCTGGCCAGCAAGAAGTCTGGAATGAACAAGAAATACCACGCCCTGTCTGTGCTGAACCAGATCATCCCCTACCTGGCTGATCAGCTGGCCGATATGTTCCCCGGAAATTTCTGCGTGACAAGCGGCCAAGACACCTATCTGTTTCGGGAAGAGCATGGCATCCCTAAGGACCACTACCTGGACGCCTACTGCATCGCCTGCAGCGCACTGACCGACGCCAAGAAGGTGAGCAGCCCTAAGGGCAGACCATACATGGTGCACCAGTTCAGAAGGCATGATAGACAGGCCTGTCACAAGGCCAATCTGAACCGGAGCTACTACATGGGCGGCAAGCTCGTTGCCACCAACCGGCACAAAGCTATGGACCAGAAAACTGACAGCCTGGAAGAGTACAGAGCCGCTCACAGCGCCGCTGACGTGTCTAAACTGACCGTGAAGCACCCTTCTGCTCAGTACAAGGATATGAGCAGAATCATGCCTGGCAGCATCCTGGTGAGCGGCGAGGGCAAACTGTTCACACTGAGCAGATCTGAGGGAAGAAACAAAGGCCAGGTGAACTACTTCGTGTCCACCGAGGGCATCAAGTACTGGGCCAGAAAGTGCCAGTATCTGCGGAACAACGGCGGACTGCAGATCTACGTG

OgeuIscB ωRNA ：

GGCTCTTCCAACTTTATGGTTGCGACCGTAGGTTGAAAGAGCACAGGCTGAGACATTCGTAAGGCCGAAAGACCGGACGCACCCTGGGATTTCCCCAGTCCCCGGAACTGCATAGCGGATGCCAGTTGATGGAGCAATCTATCAGATAAGCCAGGGGGAACAATCACCTCTCTGTATCAGAGAGAGTTTTACAAAAGGAGGAACGG

AwaIscB：其TAM为ATGA。

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AwaIscB ωRNA ：

GTCAACGAACCCCCGCCTTATGGCAGGGGCTTGTGAGGTGACTCGCAAGCCACGTTGACCAGGGAAAGCGGTAACCAACCCGCTCCGTTTACAATAGGTCGTCAAGACTCACCGGCGGATGCTTCCTCAGTCCGCCGCTCTGAAAGGTCAGGATTAGGCTGGCGCAAGGTAAAACGCCGAAGGTTCTGATCGCCGCTGCGAAGCGGGAGCCGGTTGTAGACAGTCCCGAGGGGAGCGAAGCCTTTGGGCTTCCGTTACTAGGCCCGTAAGGGCAGATGTTTGAGTGTGAATA

KraIscB-1：其TAM为ATAAA。

atgaacgtcgtctacgtcctctcgccggagagaacaccattaatgccctgtcaacctgccattgcgaggttgttgctgaaacaaggaaaagcaaaggtgaggcatcgaacgccctttacgattcagcttctcgcacagccagagcacgtgtacacacaaccgctgacccatggcgttgatacgggaagttccataatcggatcagccgtggctaatgagcatggacacgtcgtgtatctttcggaagtcgagatacgcaatgatattgcaaacactatgaaggaacgagcgagagcacgccgcaatcgtcgtcaacgcaagacacgctatcgccctgctcgctggctcaatcgcaagaaatcgatcaaaactggacgcttctcgcccaccatgagaagcaagattgatactcatctgcgagaaattcgctttatacggtccttgctgcccatcacgtctacgatactagaaacaggctcatttgatccttatgcactcagaaatcctgaagtcctgcaaaagaagtggctctaccagaggggcatcaactacggttttgccaataccaaagcctatgtgctcacacgagacggctacctctgtcagcagtgcaaagggaagtcaaaggaccgacggcttgaagttcaccacatcatcttcagaagtcgaaatggaagcgatgaggaagcgaatttactcactctctgcaaaacttgtcatgatggactccatgcaggcaccatcaccctgaaactcacaggcaagaaaaagggaaccttgcaacatgcgacccagatgaatagcatccgcattcagttactcaagcgtgttgaggcagaggaaacctggggctttgtcaccaaagagcatcgtcttctggtaggactccccaaagagcatatctttgatgcagccgtgattgcaacacgaggagtgaagccaaccttctataccacgagcgtgctctcaaaacactgtgtgtcagatggagattacaaacaaacgaaaggaaaacacggtcaacaacgagtgaacacaggtaagatcatgggatttcgcaagtttgataaggtgtactatttggggaaggagtactttatcaaggggagaatgtctaccggctacgcgatcctcatggacattgacggcaacaaaattgagttcaaaccacttcccaagtttgacaaaatgaagagagtaagtgcacgttcatcatggatgatgaaacaaagaaccacgccaaatccctcattctctatcacctcatctttgtctgcaagtgcgggaaaaaacgtttga

KraIscB-1 ωRNA ：

GTGAACTACCACTGAGCTGAAGACGCAGTGGCTTCTTCGGAAGTCACTGAAGACGCAGACCAGGAGCTCCTTCGGAAGCTTGAGTTCACCAGACTCGTTTCCAGAAATGGGAACAGCGTTCGATTGGTCATGACACCTGCGGTTGACGCATCAGACCGCTGCTCTGTCGCTGAGGGTTAAGTAGGCTTGAGGAAAGGGCCGGTGCTCTCAGCGCAAAAAGCCTTTTGAACACTGTCGAGATGAAGCCGGATTCCCTTCGTGGTCACAGCGAAGGGATACGCACCACCCGGCGCTTGCCGGAGCATTTTCCGAAAGGAGTTTT

原文链接https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856

转座子TnpB是RNA Guide的DNA核酸酶

插入序列(Insertion sequences, ISs)是一种广泛分布的可移动元件，IS200/IS605和IS607家族的ISs是最简单的可移动遗传元件，只包含其转座及其调控所需的基因。这些元件通常携带末端回文序列，编码对移动至关重要的tnpA转座酶，并通常编码必不可少的辅助tnpB基因。ISDra2 TnpA是一个非常小的Y1转座酶，切割滞后链5’TTGAT序列形成单链滚轮，然后插入到TTGAT的3’完成转座，从而不产生靶点复制（target site duplication）。虽然TnpA在IS200/IS605转座子移动中的作用已被充分证实，但TnpB的功能仍然知之甚少。有人认为，TnpB在转座调控中发挥作用，但其机制尚未确定。有趣的是，生物信息学分析表明，TnpB可能是CRISPR Cas9/Cas12核酸酶的前身。然而，TnpB的核酸酶活性和RuvC-motif在转座中的角色还没有被证明。

近期，来自立陶宛维尔纽斯大学的Tautvydas Karvelis和Virginijus Siksnys等人发现来自耐辐射球菌ISDra2的TnpB是一个RNA导向的核酸酶，相关文章发表在Nature：Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease。作者首先发现在大肠杆菌中表达tnpB需要与tnpA一起，说明可能需要额外的转座子元素稳定它的表达，并且发现RNA有RNA与TnpB共纯化。因此，他们对共纯化的RNA进行测序，发现富集的RNA与RE序列匹配（命名为reRNA）。接下来，他们假设TnpB可以被reRNA引导并切割DNA，体外用TnpB RNP和reRNA复合物、体内用表达tnpB和reRNA复合物的质粒实验证明它在reRNA的引导下剪切靠近5’TTGAT转座子相关基序(transposon associated motif, TAM)的DNA。最后，他们证明TnpB可以被重新编程切割人类细胞中的DNA靶位点。

ISDra2 TnpB:

MIRNKAFVVRLYPNAAQTELINRTLGSARFVYNHFLARRIAAYKESGKGLTYGQTSSELTLLKQAEETSWLSEVDKFALQNSLKNLETAYKNFFRTVKQSGKKVGFPRFRKKRTGESYRTQFTNNNIQIGEGRLKLPKLGWVKTKGQQDIQGKILNVTVRRIHEGHYEASVLCEVEIPYLPAAPKFAAGVDVGIKDFAIVTDGVRFKHEQNPKYYRSTLKRLRKAQQTLSRRKKGSARYGKAKTKLARIHKRIVNKRQDFLHKLTTSLVREYEIIGTEHLKPDNMRKNRRLALSISDAGWGEFIRQLEYKAAWYGRLVSKVSPYFPSSQLCHDCGFKNPEVKNLAVRTWTCPNCGETHDRDENAALNIRREALVAAGISDTLNAHGGYVRPASAGNGLRSENHATLVV*

reRNA Bone:

GATTCAAGAATCCCGAAGTGAAGAATCTTGCCGTCCGTACATGGACTTGCCCGAACTGTGGGGAAACCCATGACCGAGACGAGAACGCTGCGCTGAACATTCGGCGTGAAGCGTTGGTGGCTGCGGGAATCTCAGACACCTTAAACGCTCATGGAGGCTATGTCAGACCTGCTTCGGCGGGCAATGGTCTGCGAAGTGAGAATCACGCGACTTTAGTCGTGTGAGGTTCAA

靶点构建：

reRNA Bone+16bp Spacer +HDV 。

靶点：TTGAT（TAM）+16bp Spacer,如EMX1靶点：TTGAT GTGATGGGAGCCCTTCTTCT。

后续展望：真核生物可通过内源性转座酶实现基因编辑，只需要导入特定RNA即可。同时ReRNA大部分序列是否存在核酶的功能，也就是后续ReRNA可以精小化。