1.本文从IS200/IS605转座子重建了CRISPR-Cas9系统的进化，发现IscB使用单个 ncRNA 进行RNA 引导的双链DNA切割并且可以用于人类细胞中的基因组编辑。还证明了由 IS200/IS605转座子编码的另一个TnpB蛋白也有RNA Guide的核酸酶活性，该蛋白推测为Cas12内切核酸酶的祖蛋白。
2.这项工作揭示了一类广泛的转座子编码的RNA引导的核酸酶，本文将其命名为OMEGA（专性移动元件引导活性），具有作为生物技术发展的巨大潜力。由于TpnB分布更为广泛，后续真核基因编辑只需要导入RNA即可引导内源性核酸酶进行基因编辑。
3.同时TnpB的Spacer调控得当，可以表达单一核酸内切酶融合不同crRNA实现9~12bp Type IIS核酸内切酶，解决现有限制性内切酶瓶颈。
IscB蛋白（insertion sequence Cas9-like OrfB,参考文章Kapitonov VV et al. J Bacteriol. 2015 Dec 28;198(5):797-807.）是在IS200/IS605转座子的不同家族中编码的推定核酸酶，可能是RNA引导的核酸内切酶Cas9的祖先，但IscB的功能及其与任何RNA的相互作用仍未表征。原核RNA引导的防御系统CRISPR-Cas9（II型CRISPR-Cas）已被用于真核细胞中的基因组编辑，被认为是从IscB蛋白进化而来的。尽管其在原核生物中广泛分布并且与Cas9共享域组成和体系结构，但IscB的功能仍然未知。此外，鉴于尚未报道IscB与非编码RNA（ncRNA）或CRISPR阵列相关，Cas9系统中RNA引导活性的进化起源尚不清楚。
IscB长约400个氨基酸，含有通过插入桥螺旋（BH）和HNH内切核酸酶结构域分裂的RuvC内切核酸酶结构域，该结构与Cas9共享。对含有HNH或分裂RuvC核酸内切酶结构域的蛋白质进行了全面搜索，发现Cas9和IscB是唯一含有两个结构域的蛋白质。还显示IscB含有先前未鉴定的N末端，其与已知结构域缺乏明显的同源性，并且在Cas9中不存在，在其保守序列基序后表示PLMP。RuvC，BH和HNH结合域的聚类和系统发育分析强烈表明，所有现存的Cas9都来自单个祖先IscB。从每个簇中搜索与IscB基因相邻的CRISPR阵列，发现了六个不同的IscB组，包含16个簇（共603个），与CRISPR相关，与以前的观察相反。CRISPR相关的IscB分散在IscB系统发育树周围，这表明它们独立进化，一个关联事件导致Cas9谱系。总共鉴定了31个独特的CRISPR相关iscB基因座（共2811个）。首先检查了一组CRISPR相关的ISCB，类似于非CRISPR相关的ISCB（氨基酸同一性约为50%）。在大肠杆菌中异源表达来自该进化枝的代表性基因座并进行小RNA-seq，其显示不仅CRISPR阵列的表达，而且CRISPR阵列和IscB开放阅读之间的329碱基对（bp）基因间区域框架（ORF）。本文还纯化了IscB蛋白并对共纯化的RNA进行了测序，证明该蛋白与包含CRISPR阵列和该基因间区域的单个ncRNA组分相互作用。鉴于其与包含CRISPR直接重复（DR）和间隔区的ncRNA的相互作用，以及其与Cas9类似的结构域结构，测试了该IscB的RNA引导的核酸内切酶活性。使用先前建立的原型间隔区相邻基序（PAM）-发现测定，观察到特定PAM序列的消耗，表明CRISPR相关的ISCB是可重编程的RNA引导的核酸酶。发现IscB至少在功能上与CRISPR相关，并且可能在其他情况下，表明IscB系统更一般地共享核心祖先ncRNA基因，该基因易于进化成CRISPR阵列，并且在某些情况下是单独的反式激活CRISPR RNA。为了验证这一假设，比对了563个非冗余iscB基因座，并在iscB ORF的上游或下游搜索保守核苷酸（nt）序列。该分析揭示了ORF上游长度约300bp的高度保守的基因间区域，其5’末端的保守性下降，这对应于IS200/IS605转座子末端。共有CRISPR相关的IscB ncRNA和协方差折叠的RNA二级结构的比较揭示了高度的结构和序列相似性，特别是在共享的多干区域和假结中。推断wRNA中5′-最不保守的序列可能起指导序列的作用，因为预测紧邻下游的序列形成发夹，其结构类似于CRISPR相关IscB中DR/抗重复双链体形成的发夹ncRNA。
为了检测IscB是否能够切割与假定的wRNA指南互补的DNA，使用体外转录/翻译（IVTT）表达系统用KraIscB-1进行了体外质粒切割试验。发现KraIscB-1以wRNA依赖性方式切割靶标，具有ATAAA 3’靶标邻接基序（TAM）。使用不同的指南（Fn指南）重新定位KRAISCB-1切割同源靶标，暗示IscB是可重编程的RNA引导的核酸酶。接下来在体外对IscB进行了生物化学表征。我们通过鉴定TAM确定了86个（66%）选择的系统发育不同系统中的57个的活性。在这57个功能性ISCB中，5个可以在体外用相应的wRNA重建以实现有效的靶标切割，并且从中选择了AwaIscB用于详细的生物化学表征。证实了重组AwaIscB以可编程方式切割多个双链DNA（dsDNA）靶标的能力，并显示AwaIscB的活性依赖于镁，最适温度为35°至40°C。催化RuvC II残基（E157A）的突变消除了对非靶DNA链的核溶解活性，而HNH结构域催化突变体H212A消除了对靶链的核溶解活性。E157A和H212A突变（dAwaIscB）的组合消除了所有dsDNA核酸分解活性。切割产物的测序显示AwaIscB切割TAM上游3nt的靶链，类似于Cas9。非靶链的切割发生在TAM上游8或12 nt，产生长度为5或9 nt的5’突出端（切割不同cas9的平末端。会留粘性末端，但切割位点在识别位点内部，不能用于GoldenGate）。
RNA引导系统的显着优点是它们允许效应子通过简单地重编程RNA指导来靶向许多底物。IscB发展为使用多个指南的一种方法是与CRISPR阵列相关联。鉴于iscB基因座通常编码单个wRNA，因此不清楚这些系统通常如何或甚至是否实现这种模块化。通过搜索不直接与iscB ORF相邻的wRNA，发现了三种用于指导编码和切换的额外潜在机制：wRNA阵列，转座子扩增和独立的反式作用wRNA。wRNA阵列由多个wRNA组成，每个wRNA包含不同的指导，间隔高达200bp，并且在3356个独特的IscB/IsrB基因座中的15个（0.4%）中发现。转座子扩增涉及在多个位置插入几乎相同的IS200/IS605超家族转座子，导致每个基因组有多个基因座，每个基因座能够用独特的指导表达几乎相同的wRNA支架。相比之下，独立的wRNA更常见，并且在一些基因组中以多拷贝发现，其显示与iscB没有可检测的基因组关联。来自3356个独特IscB/IsrB基因座中的95个（2.8%）的顺式-wRNA几乎相同(≥95%序列同一性）到远端编码的独立wRNA，这意味着这些独立的wRNA可以编码反式编码的ISCB使用的指导。通过检查K.racemifer基因组中的10个独立的wRNA来测试这种可能性，其中9个被发现表达。在测试的6个独立的wRNA中，发现5个可以用来自相同基因组的远端编码的IscB介导RNA引导的DNA切割，证明单个IscB可以使用多个反式编码的wRNA。来自许多wRNA的指导，包括IscB相邻和反式编码，主要靶向原核基因组序列，表明IscB系统具有非缺失功能。
接下来研究了IscB，Cas9和其他同源蛋白之间的进化关系，以更广泛地了解RNA引导机制的进化。在寻找包含分裂的RuvC结构域的蛋白质时，检测到另一组较短的 350个氨基酸的IscB同源物，它们也编码在IS200/IS605超家族转座子中。这些蛋白质含有PLMP结构域和分裂的RuvC，但缺乏HNH结构域。将这些蛋白质IsrB（插入序列RuvC-like OrfB）重命名为强调它们独特的结构域，取代了之前的名称IscB1。除了IscB和IsrB之外，还鉴定了仅包含PLMP结构域和HNH结构域但不包含RuvC结构域的更小的蛋白质家族（约180个氨基酸），将其命名为IshB（插入序列HNH样OrfB）。为了研究这些蛋白质之间的关系，使用IQTREE 2从分裂的RuvC核酸酶和BH结构域的多重比对构建了最大似然（ML）树。在得到的树中，IsrB，IscB和Cas9形成了独特的，强烈支持的进化枝，这表明这些核酸酶中的每一个都起源于独特的进化事件。然后分析了每个蛋白质簇与IS200/IS605 tnpA基因，wRNAs，CRISPR-Cas适应基因（cas1，cas2，cas4和csn2），相应ORF上游和下游的CRISPR阵列之间的关联，以及CRISPR反重复。如上所述，iscB和isrB很少与CRISPR阵列相关，并且未发现与CRISPR-Cas适应基因相关。ISRB与结构上不同的wRNA相关。此外确定了两个不同的Cas9s组。第一种是新亚型II-D，一组相对较小的cas9s（~700个氨基酸），与任何其他已知的cas基因无关。第二个是从II-C亚型内分支的独特分支，其包括与tnpA相关的特别大的cas9s（>1700个氨基酸）。tnpA相关的II-C基因座通常包含异常长的DR（长度超过42bp），并且在一些情况下编码cas9和其他cas基因之间的HIRAN结构域蛋白。预测的转座子末端围绕这些基因座中的tnpA，cas获取基因和CRISPR阵列的各种组合。这些系统发育和关联分析证实IS200/IS605转座子编码的ISCB和ISRB与Cas9具有共同的进化历史。鉴于IsrB进化枝在树中的深部位置和缺乏HNH结构域，IsrB可能代表祖先状态，可能是从紧凑的RuvC核酸内切酶进化而来的。几乎所有ISRB都与wRNA相关；这表明这些系统在进化的早期阶段成为RNA引导的。IsrB随后获得了HNH结构域，可能是通过插入另一个移动元件或与编码IshB样蛋白的基因重组，建立了IscB家族。CRISPR阵列出现在IscB系统中多次独立的场合。这些短阵列由重复序列组成，这些重复序列可以通过复制祖先wRNA的片段而进化。得到的系统包括杂交CRISPR-wRNA，其由部分wRNA之前的CRISPR阵列组成。这些CRISPR相关的IscB蛋白可能在许多情况下也在RuvC-I和RuvC-II亚结构域之间获得REC样插入，通常与CRISPR结合同时或之后不久。特别是，一个CRISPR相关的IscB簇（簇2089）可能在标志性PLMP结构域丢失后建立了Cas9家族。此外，亚型II-D的tracrRNA，Cas9子树中的深分支显示与IscB wRNA显着相似，这表明Cas9 tracrRNA最初是从wRNA进化而来的。最后，在与CRISPR适应机制（cas1，cas2和可能的cas4）相关联后，Cas9多样化的爆发和通过水平基因转移在细菌之间的广泛分散随后，导致多种II型CRISPR亚型的进化。我们还探索了wRNA的进化历史。通过迭代构建一组跨越与ISCB和ISRB相关的所有主要RNA组的wRNA谱，我们发现不同的wRNA与几乎所有ISCB和ISRB相关。此外，不同的IsrB和IscB进化枝与不同的wRNA结构相关。从isrB到iscB的转变可能伴随着isrB相关的wRNA中转座子末端区域和多茎环之间的第二个假结，即衔接子假结的丢失。wRNA结构的复杂性与相关蛋白质大小之间的反比关系也反映在与大ISCB的进化枝相关的简化的wRNA结构和与大Cas9s相关的甚至更小的tracrRNA上。
除了产生丰富多样的II型CRISPR系统的进化事件的独特连续性之外，系统发育分析还揭示了IscB和相关蛋白进化中的其他几个事件导致了现存的多样性。首先在真核生物基因组中搜索了IscB同源物，并在陆地绿藻Ignatius tetrasporus UTEX B 2012的叶绿体基因组中鉴定了多个IscB基因座。尽管ORF在大多数这些基因座中被多个终止密码子破坏，但一个基因座编码完整的IscB（与相关的原核IscB具有约50%的氨基酸同一性）和转录活性的wRNA。该真核IscB用最小的NNG TAM切割DNA(实际应为原核生物的IscB，或者把叶绿体发展为一个遗传载体，或者部分质体基因已经转移到核基因。应该还有更多的转座子待发现，用于后续真核基因编辑。)，其不同于其他表征的IscB TAM。其次研究了大型ISCB的进化枝，其中包含一个BH域，该域通过类似REC域的插入被分成两部分。假设这些插入可能会增强DNA解旋，类似于Cas9的REC叶，因此将促进真核染色质结构复杂景观中的基因组编辑。在人类基因组中的46个位点上，发现OgeuIscB在28个这些位点诱导插入缺失，效率高达4.4%。因此，OgeuIscB似乎是进一步开发基于IscB的基因组编辑工具的有希望的候选者。第三，通过实验表征了IscB的明显祖先IsrB的假定核酸酶活性。Kracemifer含有5个与天然表达的WRNA相关的ISRB。发现IsrB-wRNA RNP以指导和TAM特异性方式切割dsDNA底物的非靶链，这类似于IscB的活性。灭活HNH结构域。最后，试图确定IS200/IS605转座子是否一般含有RNA引导的核酸酶。除了独特的IscB和IsrB家族外，大多数IS200/IS605转座子编码另一个家族的RuvC样核酸内切酶TnpB，它被认为是V型CRISPR效应子Cas12s的祖先。此外，TnpB可能是编码在不同真核转座子中的较大蛋白质Fanzors的祖先。先前的工作已经鉴定了与古细菌和细菌中tnpB基因的3’末端重叠的ncRNA，但这些ncRNA的功能尚未表征。K.racemifer的小RNA-seq揭示了与相关tnpB ORF的3’末端重叠的ncRNA的天然表达，将其归类为不同的wRNA组。KraTnpB wRNA 3’末端的反向互补几乎与与一些KraIscBs相关的wRNA的5’相同，该区域对应于每个基因座中预测的转座子末端对含有与KraTnpB聚集的tnpB基因的非冗余基因座的分析显示，在基因座的3’末端，对应于IS200/IS605转座子末端，序列保守性下降。与小RNA-seq迹线的比较显示表达超出保守下降，表明转录物中可能存在指导序列。使用重编程的指导对来自该簇的多种TnpB蛋白的体外质粒切割测定证明了用5’TAM进行RNA引导的切割。从AmaTnpB重组纯化TnpB并证实其可重编程的RNA引导的dsDNA内切核酸酶活性。在识别dsDNA或ssDNA底物时，AmaTnpB强力切割含有靶的单链DNA（ssDNA）底物并且非特异性切割侧枝底物。
通过探索Cas9进化，发现了三种高度丰富但以前未表征的转座子编码核酸酶的可编程RNA引导机制：IscB，IsrB和TnpB，统称为OMEGA（专性移动元件引导活性），因为移动元素的定位和移动可能决定了他们指南的身份。虽然OMEGA系统的生物学功能尚不清楚，但有几个假设与现有证据相符，包括促进TNP催化，RNA引导转座或作为毒素的作用，转座子作为抗毒素，确保维持IS200/IS605插入。
TnpB家族比IscB家族更加丰富和多样化，在细菌和古细菌基因组中鉴定了超过100万个推定的tnpB基因座，使其成为最常见的原核基因之一。这些TNPB可能代表了未开发的丰富的各种RNA引导机制，不仅存在于原核生物中，而且存在于真核生物中。结合对叶绿体编码的IscB的鉴定，这些发现表明RNA引导系统扩展到真核基因组中可能是一种普遍现象，更广泛地说，RNA引导系统在功能上是多样的并且渗透到生命的所有领域。
RNA表达框构建方式：snoRNA启动子+（tRNA）+Spacer（12bp左右）+ωRNA+PolyT（6~10个）。
实验相关数据：
I. tetrasporus IscB:其TAM为NNG。
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I. tetrasporus IscB ωRNA:
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OgeuIscB： 其TAM为NWRRNA。
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OgeuIscB ωRNA ：
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AwaIscB：其TAM为ATGA。
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AwaIscB ωRNA ：
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KraIscB-1：其TAM为ATAAA。
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KraIscB-1 ωRNA ：
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