疏水作用层析

原理

疏水作用层析是根据分子表面疏水性不同来分离生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团,我们把这些疏水性基团称为疏水补丁,疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同,它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同,疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

在疏水相互作用色谱中,基质材料被疏水基团取代,这些基团可以是甲基,乙基,丙基,丁基,辛基,或苯基。在高盐浓度下,蛋白质表面的非极性侧链与疏水基团“相互作用”;也就是说,两种类型的基团都被极性溶剂排除在外(疏水效应因离子强度的增加而增强)。因此,样品被应用于高度极性的缓冲器中的柱上,从而驱动分析物上的疏水基团与固定相的结合。洗脱液通常是一种水缓冲液,盐浓度降低,洗涤剂浓度增加(这会破坏疏水相互作用),或pH变化。硫酸铵经常用于这一目的。加入有机溶剂或其他不太极性的成分可能有助于提高分辨率。

操作特点

疏水层析的基本操作与其他层析大致相同。所要注意的事项有以下方面:

  • 1、层析柱的制备进行疏水层析时,所使用层析柱之规格包括柱体积大小、直径粗细、柱高度(h)与其直径(d)的比值等,均与普通层析的相似。在分离样品量较大时,宜选用体积较大的层析柱,h:d的比值应≤3。
  • 2、平衡疏水层析柱装柱完毕后,通常要用含有高盐浓度(如1mol/L (NH4)2SO4或2mol/L NaCl)的缓冲液进行平衡。
  • 3、加样与洗脱加样前,在样品溶液中要补加适量的盐类。通常加1mol/L (NH4)2SO4或2mol/LNaCl,以使样品中的生物大分子局部变性,并能与固定相很好地相互吸附。加盐的样品溶液要混匀,放置片刻后即可上柱,当把此样品溶液徐徐加入固定相(使生物大分子与固定相之间作用0.5~1h)后,先用平衡缓冲液洗涤,再用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。
  • 4、再生洗脱后的层析柱欲重复使用时,需对其固定相进行再生处理,即用含8mol/L尿素的缓冲溶液洗涤层析柱(以除去固定相吸附的杂质),接着用平衡缓冲液平衡。采用此程序处理过的疏水层析柱,可重复使用。

特点与应用

1、疏水柱层析特点:

  • (1)疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液;
  • (2)分辨率很高、流速快、加样量大;
  • (3)疏水性吸附剂种类多,选择余地大,价格与离子交换剂相当。

2、疏水柱层析应用:疏水柱层析适用于分离的任何阶段,尤其是样品离子强度高时,即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。

天地人和Phenyl Beads 6FF(High Sub)柱料

是低取代的芳香族疏水层析介质和高取代的芳香族疏水层析介质,其中苯基通过不带电、化学性质稳定的醚键连接至高度交联的6%琼脂糖微球上。

性能指标
基质高度交联的6%琼脂糖微球
配体苯基
载量(/ml介质)High Sub :约30mg lgG 、36mg HSA
粒径 (μm)45-165
建议流速(cm/h)300-600cm/h
pH 稳定范围3-13
储存缓冲液含20% 乙醇的 1XPBS
储存温度4°C – 30°C

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。 平衡/洗杂液: 0.05 M磷酸盐(可换用Tris-HCl),1.7 M硫酸铵,pH7.0 洗脱液: 0.05 M磷酸盐,pH7.0 注:疏水层析介质缓冲液可根据不同介质及纯化物质不同做适当改变,原则上高盐上样低盐洗脱。.

纯化

孵育法纯化
  • 1)根据纯化的样品量,取适量Phenyl Beads 6FF(High Sub)加入离心管中,1000 rpm离心1 min,吸弃,上清;也可加入重力柱中,流干保护液。
  • 2)向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质,1000 rpm离心1 min,吸弃上清;如使用重力柱,则直接在重力柱中清洗,直接重力流干平衡液;重复两次以上。
  • 3)加入样品,封闭离心管或重力柱管,4’C振荡孵育2-4 h或者37C孵育30 min-2 h。
  • 4)孵育结束后,1000 rpm离心1 min,吸弃上清,或过滤收集介质,上清保留作为流穿,用于电泳鉴定。
  • 5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质,1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤,去除上清(注意不要吸到介质),重复3-5次,中间建议更换新离心管。
  • 6)加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱,室温孵育10-15 min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液,可重复2-3次。
重力柱法纯化
  • 1)将装填好的Phenyl Beads 6FF(High Sub)重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下,重复2-3次。
  • 2)将样品加到平衡好的重力柱中,样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触,收集流出液,可以反复上样增加结合效率
  • 3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
  • 4)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱,分段收集,每0.5个柱体积收集1管,分别检测,既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱,又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
中压层析柱法纯化

Phenyl Beads 6FF(High Sub)装填好后,可以用各种常规的中低压色谱系统。

  • 1)将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子,将层析柱连接至色谱系统中,打开下出口,将预装柱接到色谱系统中,并旋紧。
  • 2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
  • 3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
  • 4)利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少,也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。 大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
  • 5)用洗杂液冲洗柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
  • 6)用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中,通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多,来分离不同结合强度的蛋白质。
  • 7)上述步骤介质洗脱结束后,先用平衡液冲洗3倍柱体积,然后用纯水冲洗5倍柱体积,再用20%乙醇冲洗2个柱体积,然后将介质置于2-8℃保存。

注:疏水作用随着温度的降低而降低。可采用非极性有机溶剂如40~50%乙二醇、30%异丙醇或1%去污剂TritonX-100洗脱。

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